马丽晶1

韩德民2

张伟2

王鸿2

范而钟2

王津津3 A Tentative Study on Establishment and characterization of a human laryngeal squamous carcinoma cell line Ma Lijing1

Han Demin2

Zhang wei2

Wang Hong2

Fan Erzhong2

Wang Jinjin3 1．首都医科大学九九级博士生，首都医科大学附属最新老虎机,新老虎机平台医院，北京市耳鼻咽喉科研究所 2．首都医科大学附属最新老虎机,新老虎机平台医院，北京市耳鼻咽喉科研究所 3．首都医科大学附属最新老虎机,新老虎机平台医院中心实验室 1．MD of Capital University Medical Sciences in 1999 the Department of ENT of Affiliated Beijing Tongren Hospital of Capital University Medical Sciences ENT Institute 2．the Department of ENT of Affiliated Beijing Tongren Hospital of Capital University Medical Sciences ENT Institute 3．the Center Laboratory of Affiliated Beijing Tongren Hospital of Capital University Medical Sciences [摘要] 目的 建立人喉鳞状细胞癌细胞系，为喉癌研究提供新的实验模型。方法 采用体外原代组织块培养方法，对经病理证实为鳞状细胞癌的新鲜喉癌手术标本进行培养；对存活细胞进行形态学观察、免疫细胞化学染色、细胞周期检查、核型分析、电镜观察和裸鼠移植等。结果 LSC-1细胞系在体外连续培养4月，光镜下观察为上皮样，似铺路石样排列，细胞呈异型性，核分裂相增多；电镜下见细胞表面有大量的微绒毛和突起，胞浆中可见张力原纤维；细胞角蛋白染色为阳性；细胞的倍增时间为22.84小时，在软琼脂中的克隆形成率为47.77%；细胞周期测定：G0/G1期74.61%，G2/M期7.78%，S期17.6%，G2/G1=1.87，DI=2.40；染色体众数为69条；裸鼠移植成功率为100%。结论 LSC-1是一株人喉鳞状细胞癌细胞系，可用于对喉癌的研究。 关键词：喉肿瘤

鳞状细胞癌

细胞培养

细胞系 Abstract Objective To establish a new laryngeal carcinoma cell line and to provide a new experimental model for the research of laryngeal carcinoma. Methods The specimens which were identified pathologically as laryngeal squamous carcinoma were cultured, using primary tissue culture in vitro. The surviving cells were analyzed by morphology, histocytochemistry, cell cycling analysis, karyotype analysis, electron microscopic observation and heterotransplantation. Results A newly established cell line, which was designated LSC-1 had been maintained in continuous culture for 4 months. The morphologic type of cells was epithelial and pleomorphic. Mitoses was numerous. Electron microscope showed the surface of cells has many microvilli and process. Tonofibrils were present in the cytoplasm. The cytokeratin staining was positive. The doubling time of cells was about 22.84 hours. The cell cycle analysis showed: G0/G1 74.61%, G2/M 7.78%, S 17.6%, G2/G1=1.87, DI=2.40. The chromosome analysis showed a heteroploid feature and the success rate of heterotransplantation was 100%. Conclusions The LSC-1 is a cell line derived from human laryngeal carcinoma and can serve as a model for further studies of laryngeal carcinoma. Key words: laryngeal neoplasms；carcinoma；cell line；cell culture 喉癌是我国头颈部常见的恶性肿瘤之一，近几十年来，传统的治疗方式如手术、放疗及化疗等都有了很大的改进，但晚期喉癌的疗效仍不尽人意。体外培养的肿瘤细胞是研究肿瘤细胞生物学特性、癌变机理和癌症治疗的良好生物学模型，细胞系的建立允许详细分析生物学、形态学、抗原性和细胞原性的特征。我们应用细胞培养技术，对喉肿瘤组织进行原代培养，并建立一株喉癌细胞系，命名为LSC-1，现将建系过程及其生物学特性报告如下。

一、 材料和方法 1．标本来源

患者男性，38岁，2001/6/5因声带癌而行激光声带切除术，术后3个月复发，于2001/11/7行次全喉切除术。两次手术标本均送病理科进行组织学检查，同时取新鲜无坏死肿瘤组织进行组织培养。第一次手术后的标本培养未能成功；LSC-1细胞系的肿瘤组织来源于该患者二次手术时的喉部标本。两次手术标本的病理均为中等分化的鳞状细胞癌。 2．实验动物

BALB/C nu/nu裸鼠，雌雄兼具，35周龄，购自卫生部药品生物制品鉴定所实验动物中心及中国医学科学院肿瘤医院动物室。饲养条件：恒温26±1℃，恒湿50%~70%；饮水、饲料、垫料及笼具均经高压灭菌，并在无均操作下定期更换。 3．建系过程

无菌条件下取新鲜肿瘤组织1~2cm2，浸泡于含有双抗（青霉素100μ/ml、链霉素100μg/ml）及两性霉素B（2μg/ml）的生理盐水中，送实验室。浸泡2~3小时，用含有双抗及两性霉素B的无菌生理盐水及RPMI1640培养液各冲洗3遍，剪成1mm3小组织块，接种两个25cm2培养瓶及一个6孔培养板。将小组织块贴附于培养瓶底部，加入少量含10%血清的培养液，将培养瓶倒置，放入37℃、含5%CO2及一定湿度的CO2培养箱中培养，2h后翻转培养瓶，使肿瘤组织块浸泡于培养液中。第二天少量补液，每天观察细胞生长情况。培养第7天，可见贴壁肿瘤组织块周围有肿瘤细胞爬出，同时在远离肿瘤组织块处有贴壁肿瘤细胞团生长；随着培养时间延长，贴壁的组织块逐渐脱落，贴壁的肿瘤细胞团不断增大，中心部位的细胞脱落，贴壁后形成新的肿瘤细胞团；培养第27天，六孔培养板中的上清液含大量脱落肿瘤细胞，将其移至另一六孔板，肿瘤细胞重新贴壁生长；培养第39天，用0.25%胰酶消化六孔板中的细胞，进行第一次传代，并命名为LSC-1，以后每周传代1~2次。成纤维细胞的清除采用胰酶时间差消化法[1]。 4．细胞系的维持、冻存与复苏

取对数生长期细胞，用D-Hanks 液漂洗3遍，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化细胞5min，收集细胞，离心1000rpm，5分钟，用培养液重悬细胞，1瓶细胞分种3~5瓶，同时冻存适量细胞，冻存液为培养液中加入10%血清及8%二甲基亚砜，放入液氮罐中永久保存。将盛有LSC-1细胞的冷冻管从液氮中取出（保存3个月），37℃水浴，使细胞融化，将细胞悬液移入预温至37℃、含有10%血清的培养液中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞的成活率大于90%。 5．形态学观察 5．1 相差显微镜

观察体外培养细胞的生长状态，并进行照相。 5．2 光学显微镜及免疫细胞化学染色

将细胞接种于放有盖玻片的小平皿中，长成单层，经PBS洗涤后，用丙酮甲醇混合物固定，做常规HE染色及细胞角蛋白免疫组化染色。 5．3 电子显微镜

分别将LSC-1细胞接种于25 cm2培养瓶及预先放置有盖玻片的小平皿中。接种后第二天，将培养瓶中的细胞用细胞刮刮下，离心，沉淀的细胞团用2.5%戊二醛及1%锇酸双固定，Epon 812包埋，超薄切片、染色，在JEM-1010透射电镜下观察；将附有单层细胞的盖玻片用2.5%戊二醛及1%锇酸双固定、梯度酒精脱水、置换、干燥及喷金，在JSM-6000F扫描电镜下观察。以Hep-2细胞为对照。 6．细胞生长动力学 6．1生长曲线的测定

将LSC-1细胞接种于35mm小培养皿中，接种细胞量1×104细胞/皿，置于CO2培养箱中进行培养；每天随机取3皿，用0.25%胰酶将细胞消化下来，经台盼蓝染色计数活细胞，连续10天，绘制细胞生长曲线。根据下列公式计算细胞倍增时间[19]。以Hep-2细胞系为对照。 细胞倍增时间（TD）=

（N0、Nt 分别代表接种后及培养t小时后的细胞数） 6．2 细胞分裂指数

将LSC-1细胞接种于预先放置有盖玻片的35 mm培养皿中，接种细胞量1×104细胞/皿，置于CO2培养箱中进行培养；每天随机取1皿，用丙酮和甲醇的混合物固定，常规HE染色、封片，镜下计数1000个细胞中的分裂相，绘制细胞分裂指数曲线图。 6．3 细胞贴皿率

取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化细胞制成细胞悬液，计数后接种35mm培养皿12皿，5×105细胞/皿，每2h取出一皿细胞，倒掉培养液，计数已贴壁细胞，观察12小时，计算贴壁率：

贴壁率%（接种存活率）=

6．4软琼脂细胞克隆形成

采用双层琼脂糖培养法[20]，先将1%琼脂糖与预温至37℃的2×MEM等体积混合均匀，浇入24孔培养板中，0.8ml/孔，置室温使琼脂凝固；取对数生长期细胞，制备成1×103细胞/ml的细胞悬液，与1%琼脂混合均匀，制备成含细胞的0.3%琼脂培基，浇入铺有底层琼脂的24孔培养板，0.8ml/孔，使第一行每孔25个细胞，第二行每孔50个细胞，第三行每孔100个细胞，将培养板移入CO2培养箱，置于37℃、5%CO2及饱和湿度环境下培养，于2周左右可见克隆形成，计数集落形成率。 7．细胞生物学性状鉴定 7.1 染色体分析

取对数生长期细胞2瓶，加入终浓度为0.04μg/ml的秋水仙素，5%CO2、37℃孵育2h，吸出培养液，用0.25%胰酶消化细胞，离心1500rpm，8min，弃上清，加入0.075M KCl，37℃水浴20min，离心弃上清，加入新鲜配制的固定液（甲醇∶冰醋酸 = 3∶1），室温固定10min，离心后弃上清，重复固定一次，滴片，室温干燥，进行G显带，计数100个分裂中期的染色体，进行核型分析。 7.2 DNA倍体分析

取对数生长期细胞1×106制备成细胞悬液，按照试剂盒说明进行操作，用流式细胞仪进行检测。以Hep-2细胞系作对照。 7.3 裸鼠成瘤实验

取对数生长期细胞制备成细胞悬液接种裸鼠，接种量1×106细胞/只或5×106细胞/只，其中LSC-1细胞接种裸鼠11只，雌雄兼具，Hep-2细胞接种裸鼠6只，雄性；观察成瘤率、肿瘤潜伏期及肿瘤生长曲线。当瘤体直径达1cm以上时，照相后处死，取出肿块作病理组织学检查，部分裸鼠对全身重要脏器进行病理学检查，注意有无局部淋巴结及全身转移。 三、 结果 1．形态学观察

在相差倒置显微镜下，活细胞为上皮样形态，多边形，似铺路石样排列，可重叠生长（图1）。HE染色可见细胞具有高度的异型性，细胞形态及大小不一致；核呈多形性，大小、形态及染色不一致；胞核与胞浆比例增大（接近1∶1），核仁肥大，数目增多，可达3~5个，核分裂相增多，出现不对称、多极性等病理性核分裂，偶见巨核细胞（图2）。扫描电镜见细胞表面有大量的微绒毛及突起，新生细胞呈圆形（图3）。透射电镜下可见，细胞核明显增大，核膜可有内陷或外凸，核的形态不规则，核异染质增多，凝集成块状或聚集在核膜下，核仁增大，数目增多，形状和位置不规则。胞浆中可见张力原纤维，显示出鳞状上皮癌的特征（图4）。 2．免疫细胞化学染色

细胞角蛋白染色为阳性证实LSC-1细胞来源于上皮细胞。（图5） 3．生长曲线

在含有10%加强型小牛血清的RPMI1640培养液中，LSC-1细胞系的群体倍增时间是22.84小时，Hep-2细胞系是25.16小时。（图6） 4．细胞分裂指数

（图7、8） 5．细胞贴皿率

2小时为68.45%，4小时为87.8%，8小时为94.05%。 6．软琼脂细胞克隆形成

LSC-1细胞在软琼脂中的克隆形成率为47.77%，相差显微镜下见一个细胞克隆成桑椹状，细胞圆形，透亮，排列成团。（图9） 7．核型分析

分析100个分离中期细胞，染色体数目波动在53~112之间，众数为69，染色体有缺失、断裂、易位等结构异常。（图10） 8．细胞周期分析

流式细胞仪分析结果显示G0/G1 74.61%, G2/M 7.78%, S 17.6%, G2/G1=1.87, DI=2.40。 9．裸鼠移植成瘤

LSC-1细胞系接种11只裸鼠，成瘤率为100%，肿瘤形成潜伏期为26~49天（平均35天）；Hep-2细胞接种6只裸鼠，成瘤率为100%，肿瘤形成潜伏期为8天。（图11）当移植瘤直径达1cm时，将LSC-1细胞接种裸鼠处死，取下肿瘤。从大体形态上观察，肿瘤为多发或单发，实性，包膜完整，包膜表面有丰富的血管，切面白色，质脆，中心有坏死液化；病理组织学证实，LSC-1细胞接种裸鼠后形成的肿瘤为鳞状上皮细胞癌，分化较差，其形态与原肿瘤相似，全身重要脏器及局部淋巴结病理学检查均未见转移。（图12） 四、讨论 喉癌是我国头颈部常见的恶性肿瘤之一，近几十年来，传统的治疗方式如手术、放疗及化疗等都有了很大的改进，但晚期喉癌的疗效仍不尽人意。由于从原发病变部位的新鲜肿瘤组织很难获得足够数量的细胞用于实验研究，细胞系的建立可以为肿瘤的研究提供大量细胞。早在20世纪50年代，国外就有了一些有关喉癌及其他头颈癌细胞系建立的报道。1955年， Moore等[2]建立了Hep-2细胞系（来源于喉鳞癌）及其它三个鳞癌细胞系。1978年，Krause等[3]从194例头颈部鳞癌患者的标本中建立了3个细胞系。到了20世纪80年代，有关头颈部鳞癌细胞系建立的文献报道逐渐增多[4、5]。目前国内用于喉癌研究的主要是Hep-2细胞系及裸鼠移植瘤细胞系，至今为止，尚无我国自行建立的喉癌细胞系。我们应用体外培养技术对24例喉鳞癌组织进行培养，建立了LSC-1细胞系，通过对该细胞系的形态学、生长动力学及生物学特性的观察，证实LSC-1细胞系是来源于人喉鳞癌组织的恶性肿瘤细胞系，可用于喉癌的基础研究。 LSC-1细胞系来源于一男性喉癌患者的手术标本，肿瘤组织经临床病理证实为鳞状细胞癌。在体外传代培养过程中，肿瘤细胞为贴壁生长的上皮样细胞，由于失去接触抑制而重叠生长，细胞增殖较快、分裂周期较短，群体倍增时间为22.84小时；染色体数目范围53~112，众数为69；DNA倍体分析结果为G0/G1期74.61%，G2/M期7.78%，S期17.6%，G2/G1=1.87， DI=2.40，证实细胞生长活跃，为异倍体细胞，这些结果提示LSC-1细胞系具有恶性肿瘤细胞的特性。研究表明，在所有正常复层鳞状上皮细胞、培养细胞及大部分来源于复层鳞状上皮的肿瘤细胞中都存在分子量为50kd和58kd的角蛋白，用它们的单克隆抗体AE1和AE3通过免疫过氧化物酶染色可以证实[6]。我们应用AE1/AE3细胞角蛋白抗体进行免疫组化分析，染色为阳性证实LSC-1细胞为上皮源性。 在扫描电镜下观察到肿瘤细胞表面有许多微绒毛和突起。研究表明，细胞表面的微绒毛和突起与细胞的粘附能力有关，生长于胶原凝胶表面的细胞，借助这些微绒毛粘附于胶原纤维；并且微绒毛的数量和排列与肿瘤细胞的转移有关[7]。LSC-1细胞扫描电镜下见细胞表面有大量的微绒毛和突起，透射电镜下见细胞形态不规则，核膜凹陷或突起，核浆比例失调，符合肿瘤细胞的特征。 除了细胞系的形态学特征，还可通过血清依赖性、非锚着生长依赖性及在裸鼠体内的致瘤性来证实肿瘤细胞具有恶性生长的特性。除血细胞外，正常细胞一般必须贴附在固相表面才能生长，称为锚着依赖性生长；然而肿瘤细胞在悬浮状态（如0.3%的软琼脂）下也能生长繁殖，形成细胞球形体（cell spheroid formation），即细胞克隆或集落。不同细胞系的克隆形成率不同。通过克隆形成率可对单个细胞的增殖潜力作定量分析，了解细胞的增殖能力和对生存环境的适应性，克隆形成率高者其独立生存能力强，细胞的恶性程度也高。LSC-1细胞系的克隆形成率为47.77%，与文献报道Hep-2细胞系的相近。 细胞在裸鼠体内的致瘤性是检测细胞具有恶性特性的方法之一，文献报道，肿瘤细胞系在裸鼠体内的成瘤率与细胞的来源、分化程度以及裸鼠的年龄、健康状态、品系、免疫力等有关[8]。我们将不同数量的喉癌细胞（Hep-2和LSC-1）接种于鼠龄为3~5周的裸鼠皮下，成瘤率为100%，LSC-1细胞的成瘤潜伏期与Hep-2细胞相比明显延长，且肿瘤的生长速度较慢，这与在体外培养时两种肿瘤细胞的倍增时间相近（LSC-1细胞为22.84h，Hep-2细胞为25.16h）并不一致，推测可能是由于LSC-1细胞在体外的培养时间较短，细胞的异质性较大，而在体外长期培养的细胞趋向于细胞均一化。LSC-1细胞接种裸鼠后形成的肿瘤在组织病理学和超微结构上，保留了最初活检标本的典型特征，分化程度较低，细胞内可见张力原纤维、桥粒等。 我们通过体外培养技术对人喉鳞癌组织进行培养，并建立了细胞系LSC-1，到目前为止，该细胞系在体外已连续传代培养4个月，性质稳定，但尚未达到永生化，此外有关细胞系的药物敏感实验及细胞表面的分子表达情况的研究尚未进行，仍需进行深入研究。 参考文献： 1． 司徒镇强, 吴军正主编. 细胞培养. 西安: 世界图书出版西安公司. 1996,4. p136. 2． Moore AE, Sabachewsky L, Toolan HW. Culture characteristics of four permanent lines of human cancer cells. Cancer Res, 1955,15: 598-602. 3． Krause CJ, Carey TE, Ott RW, et al. Huamn squamous cell carcinoma. Establishment and characterization of new permanent cell lines. Arch Otol. 1981, 107:703-710. 4． Easty DM, Easty GC, Carter RL, et al. Ten human carcinoma cell lines derived from squamous carcinomas of the head and neck. Br J Cancer. 1981,43:772-785. 5． Sacks PG, Parnes SM, Gallick GE, et al. Establishment and characterization of two new squamous cell carcinoma cell lines derived from tumors of the head and neck. Cancer Res. 1988,48:2858-2866. 6． Nelson WG, Battifora H, Santana H, et al. Specific kerations as molecular markers for neoplasms with a stratified epithelial origin. Cancer Res. 1984,44:1600- 1603. 7． Reith A, Puntervold R and Saxholm HJK. A quantitative SEM study of microvilli in interphase and mitosis of carginogen-transformed fibroblasts. Scanning Electron Microscopy. 1980,31:23-28. 8． Robinson KM and Maistry L. Tumorigenicity and other properties of cells from ten continuous human esophageal carcinoma cell lines in nude mice. JNCI. 1983,70:89-93. 总字数（包括参考文献）：4874字 图6

细胞生长曲线 图7

LSC-1细胞分裂指数